酵母雙雜交法原理（酵母雙雜交基本原理）

關(guān)于酵母雙雜交法原理，酵母雙雜交基本原理這個問題很多朋友還不知道，今天小六來為大家解答以上的問題，現(xiàn)在讓我們一起來看看吧！

1、雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認(rèn)識。

2、細(xì)胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。

3、80年代的工作表明，轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的（modular）, 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成, 其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，簡稱為BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，簡稱為AD），它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。

4、前者可識別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。

5、兩個結(jié)構(gòu)域不但可在其連接區(qū)適當(dāng)部位打開， 仍具有各自的功能。

6、而且不同兩結(jié)構(gòu)域可重建發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用。

7、酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過激活報道基因的表達(dá)探測蛋白－蛋白的相互作用。

8、單獨的BD雖然能和啟動子結(jié)合，但是不能激活轉(zhuǎn)錄。

9、而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的BD和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。

10、如酵母細(xì)胞的Gal4蛋白的BD與大腸桿菌的一個酸性激活結(jié)構(gòu)域B42融合得到的雜合蛋白仍然可結(jié)合到Gal4結(jié)合位點并激活轉(zhuǎn)錄。

11、主要有二類載體： a 含DNA -binding domain的載體； b 含DNA-activating domain的載體。

12、一般編碼一個蛋白的基因融合到明確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA－結(jié)合結(jié)構(gòu)域(如GAL4-bd， LexA-bd）； 另一個蛋白的基因融合到轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（如GAL4-ad， VP16）。

13、上述二類載體在構(gòu)建融合基因時， 測試蛋白基因與結(jié)構(gòu)域基因必須在閱讀框內(nèi)融合。

14、融合基因在報告株中表達(dá)， 其表達(dá)產(chǎn)物只有定位于核內(nèi)才能驅(qū)動報告基因的轉(zhuǎn)錄。

15、例如GAL4-bd具有核定位序列（nuclear-localization sequence）， 而GAL4-ad沒有。

16、因此， 在GAL4-ad氨基端或羧基端應(yīng)克隆來自SV40的T-抗原的一段序列作為核定位的序列。

17、目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4（1-147）; LexA (E coli轉(zhuǎn)錄抑制因子）的DNA-bd編碼序列。

18、常用的activating-domain基因有：GAL4（768-881）和皰疹病毒VP16的編碼序列等。

19、雙雜交系統(tǒng)的另一個重要的元件是報道株。

20、報道株指經(jīng)改造的、含報道基因（reporter gene）的重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。

21、最常用的是酵母細(xì)胞， 酵母細(xì)胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點： 〈1〉 易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴(kuò)增質(zhì)粒。

22、〈2〉具有可直接進(jìn)行選擇的標(biāo)記基因和特征性報道基因。

23、〈3〉酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結(jié)合。

24、激活結(jié)構(gòu)域融合基因轉(zhuǎn)入表達(dá)結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合基因的酵母細(xì)胞系中， 蛋白間的作用使得轉(zhuǎn)錄因子重建導(dǎo)致相鄰的報道基因表達(dá)（如lacZ）， 從而可分析蛋白間的結(jié)合作用。

25、酵母雙雜交系統(tǒng)能在體內(nèi)測定蛋白質(zhì)的結(jié)合作用， 具有高度敏感性。

26、主要是由于：①采用高拷貝和強(qiáng)啟動子的表達(dá)載體使雜合蛋白過量表達(dá)。

27、②信號測定是在自然平衡濃度條件下進(jìn)行， 而如免疫共沉淀等物理方法為達(dá)到此條件需進(jìn)行多次洗滌，降低了信號強(qiáng)度。

28、③雜交蛋白間穩(wěn)定度可被激活結(jié)構(gòu)域和結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物而增強(qiáng)， 后者又與啟動子DNA結(jié)合， 此三元復(fù)合體使其中各組分的結(jié)合趨于穩(wěn)定。

29、④通過mRNA產(chǎn)生多種穩(wěn)定的酶使信號放大。

30、同時， 酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表達(dá)等檢測方法均很敏感。

本文分享完畢，希望對大家有所幫助。

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