你的細(xì)菌培養(yǎng)物還在生長嗎？測量在底漆外徑600處進(jìn)行

這篇文章是給那些想知道“我怎么知道我的細(xì)菌培養(yǎng)什么時(shí)候‘結(jié)束’的人看的？”什么時(shí)候可以收獲細(xì)胞？

細(xì)菌生長曲線概述

讓我們回顧一下細(xì)菌生長曲線的四個(gè)基本階段：log階段、滯后階段、靜止階段和死亡階段(圖1)。在此期間，細(xì)胞正在適應(yīng)和調(diào)整自己的新環(huán)境。然后，培養(yǎng)物進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在此期間細(xì)胞迅速分裂，數(shù)量翻倍(在對(duì)數(shù)期大腸桿菌每20分鐘翻倍)。當(dāng)您在液體培養(yǎng)基中達(dá)到最大細(xì)胞密度時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入靜止期。在這個(gè)階段，細(xì)胞數(shù)量整體上沒有增加。33，354個(gè)死亡細(xì)胞被新分裂的細(xì)胞取代，但活細(xì)胞總數(shù)保持不變。如果你在研究孢子形成細(xì)菌，這可能是營養(yǎng)細(xì)胞孢子形成或新孢子形成的階段。最后，死亡(或衰退)階段是由多種因素引起的，包括營養(yǎng)或氧氣的缺乏，細(xì)胞代謝引起的培養(yǎng)基酸堿度的變化，或有毒細(xì)胞廢物的積累。

使用OD600來確定您的文化處于哪個(gè)階段。

最簡單的方法是測量OD600或600 nm的光密度，以測量介質(zhì)在其生長曲線上的距離。這個(gè)波長是專門為細(xì)菌OD測量選擇的，因?yàn)榕c紫外線波長不同，600納米對(duì)培養(yǎng)無害。這種波長通常不會(huì)被像TSB和LB這樣的黃色介質(zhì)吸收。通過監(jiān)測OD600的生長速度，可以確定培養(yǎng)物的滯后期、記錄期和穩(wěn)定期。

那么如何衡量呢？對(duì)于懸浮在液體中的簡單細(xì)胞，首先需要零或“空白”分光光度計(jì)和新鮮、未接種的培養(yǎng)基減去培養(yǎng)基對(duì)測量的任何吸收貢獻(xiàn)。然后，拿起你的文化樣品，測量OD600。這種測量方法可以很容易地計(jì)算出燒瓶中每毫升培養(yǎng)細(xì)胞的總數(shù)。不錯(cuò)吧。盡管如此，還是有一些事情需要注意。

當(dāng)你取培養(yǎng)基樣本時(shí)，一定要混合好，并立即測量，因?yàn)榧?xì)胞可能在大約一分鐘內(nèi)開始沉淀，這將導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。

如果細(xì)菌在溶液中形成生物膜或聚集體，將嚴(yán)重影響測量的準(zhǔn)確性和精度。在這種情況下，您可能需要超聲處理或進(jìn)一步處理培養(yǎng)物來分解這些“簇”。查閱關(guān)于您用來避免或消除此問題的菌株的文獻(xiàn)。

最重要的是，1的OD值不準(zhǔn)確！如此高的OD讀數(shù)超出了大多數(shù)分光光度計(jì)的動(dòng)態(tài)范圍，這意味著這些讀數(shù)不會(huì)隨著細(xì)胞濃度的增加而線性增加。如果您得到的OD值大于1，將您的樣品稀釋2倍或更多，直到它達(dá)到OD600 1。

如果你經(jīng)常在燒瓶中培養(yǎng)細(xì)菌，訓(xùn)練自己用眼睛估計(jì)OD值是有幫助的。這樣，當(dāng)燒瓶明顯超出你要找的OD范圍時(shí)，跳過OD600檢查可以節(jié)省寶貴的時(shí)間。有關(guān)更多信息，請(qǐng)參見本文，并考慮使用微孔板讀數(shù)器來提高OD測量的吞吐量。

其他監(jiān)測生長和代謝的方法

雖然使用培養(yǎng)物的OD600來監(jiān)測生長是一種成熟且真實(shí)的方法，但還有其他幾種方法來評(píng)估細(xì)菌培養(yǎng)物的生長和代謝。您可能會(huì)發(fā)現(xiàn)其中一些因素對(duì)您的特定應(yīng)用更相關(guān)或更有用！

通過收集培養(yǎng)物的樣品并在顯微鏡下檢查，你可以開始知道培養(yǎng)物中活細(xì)胞的大致濃度。額外的好處：你可以比較細(xì)胞的圖片，看看是否有不同的形態(tài)批次，或者一個(gè)孢子形成過程中培養(yǎng)了多少營養(yǎng)細(xì)胞。

溶解氧和二氧化碳。考慮啤酒(由酵母制成)、康普茶(由酵母和各種細(xì)菌制成)以及其他由微生物發(fā)酵的飲料。在這些例子中，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，氧氣(O2)被消耗，二氧化碳(CO2)形成。同樣的過程發(fā)生在需氧細(xì)菌培養(yǎng)中！溶解氧和CO2探針是生物反應(yīng)器中常用的探針。如果你想要一個(gè)微創(chuàng)的選擇，有光學(xué)傳感器(和貼片)，使用LED熒光監(jiān)測從外面溶解2瓶！

大多數(shù)細(xì)菌，包括大腸桿菌，會(huì)隨著時(shí)間的推移降低培養(yǎng)基的酸堿度。對(duì)于一些物種來說，酸的產(chǎn)生實(shí)際上限制了培養(yǎng)物的最大生長和生存能力。像氧傳感器一樣，有一種方法可以無創(chuàng)地連續(xù)監(jiān)測燒瓶中的酸堿度。

糖的分析。使用一些儀器，可以快速可靠地測定生長培養(yǎng)基中的殘留糖。例如，如果您的培養(yǎng)基中的主要碳源是葡萄糖，那么在細(xì)菌生長中間獲取葡萄糖測量數(shù)據(jù)可以讓您知道培養(yǎng)基在生長曲線中的位置。

那么什么時(shí)候應(yīng)該收獲一種文化呢？

簡而言之，這完全取決于文化的最終目標(biāo)是什么。例如，我培養(yǎng)并誘導(dǎo)了大量大腸桿菌過度表達(dá)非天然蛋白質(zhì)，然后從培養(yǎng)物中純化它們。我經(jīng)常發(fā)現(xiàn)我從培養(yǎng)中獲得的蛋白質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量取決于我收獲時(shí)的相細(xì)胞。然而，在其他情況下，目標(biāo)只是獲得盡可能多的細(xì)胞。

一旦你知道了需要收集的細(xì)胞的具體生長階段，一定要進(jìn)行一些測試(包括測量)，確保你對(duì)細(xì)菌生長時(shí)間的評(píng)估是正確的。這將讓你強(qiáng)烈地感覺到你的文化需要多長時(shí)間來準(zhǔn)備收獲，并提供歷史數(shù)據(jù)來比較增長曲線?？偸菑囊粋€(gè)小的“種子”培養(yǎng)開始，以獲得一個(gè)可靠的和不斷增長的燒瓶。最后，如果你不習(xí)慣減少污染的風(fēng)險(xiǎn)，你可以多次測試你的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。

從相對(duì)簡單的O

D測量到代謝物分析，有很多方法可以監(jiān)視實(shí)驗(yàn)室中正在生長的細(xì)菌。由于生長階段對(duì)文化有很大影響，知道如何準(zhǔn)確測量這個(gè)參數(shù)是任何細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室的關(guān)鍵技術(shù)!