當AlexRosenberg博士和CharlieRoco博士還是華盛頓大學GeorgSeelig實驗室的研究生時，他們在白板上提出了如何提高單細胞RNA測序(scRNA-seq)可擴展性的想法。當時，大約五年前，“大規(guī)模約為100個細胞，”羅森伯格說。他們將自己的想法發(fā)展為基于分割池連接的轉錄組測序(SPLiT-seq)的技術。
Rosenberg表示，2018年概念驗證論文在《科學》雜志上發(fā)表后，電子郵件就開始滾滾而來。他說，“大量”團體主動聯(lián)系，詢問如何在自己的系統(tǒng)中設置SPLiT-seq實驗室。兩名學生一獲得博士學位，就抓住了這個機會，創(chuàng)辦了一家名為SplitBiosciences(最近更名為ParseBiosciences)的公司，將該技術商業(yè)化。
ParseBiosciences的研究人員。
上周，在美國人類遺傳學學會(ASHG)年度會議上，ParseBio團隊發(fā)布了一款配有數(shù)據(jù)分析軟件的新試劑盒。該產(chǎn)品允許任何研究人員使用單細胞懸浮液并進行DNA測序，對多達100萬個細胞進行scRNA-seq。
更好的捕鼠器
就在Rosenberg和Roco發(fā)表SPLiT-seq論文的三年前，來自波士頓的兩個研究小組——一個來自布羅德研究所，由EvanMacosko博士領導，另一個來自哈佛醫(yī)學院，由MarcKirschner博士領導——連續(xù)發(fā)表了《細胞》雜志上的論文描述了基于微流體的方法來分離液滴中的單個細胞。第二年，10XGenomics推出了基于這些技術的Chromium系統(tǒng)。從那時起，10XGenomics已成為該領域的既定領導者，并幫助發(fā)起了scRNA-seq革命。
但羅森伯格認為還有改進的空間，并且ParseBio的試劑盒比當今現(xiàn)有的技術更好。他說，由于SPLiT-seq的簡單性，它缺乏基于液滴的方法中的一些限制。一個例子是，細胞的大小在SPLiT-seq中并不重要。這一優(yōu)勢以及其他優(yōu)勢使得scRNA-seq更易于使用且更容易擴大規(guī)模。
細胞是隔室
單細胞正是如此，基于微流體的系統(tǒng)促進了細胞的物理分離。每個細胞都位于其自己的單獨隔室中，可以用特定于其部分的條形碼單獨標記。
但SPLiT-seq的工作原理不同——細胞之間并不是物理隔離的。細胞是隔室。為此，細胞被固定然后透化。生化試劑進入細胞，細胞內(nèi)發(fā)生化學反應，并添加條形碼。使用組合條形碼，該方法可以標記大量細胞。
理論上，無需額外的臺式機器，任何分子生物學實驗室都可以使用SPLiT-seq進行scRNA-seq實驗。使用完試劑盒后，即可制備出可在任何測序儀上進行測序的文庫。然后使用套件中包含的軟件分析數(shù)據(jù)。
ParseBio自今年2月起推出了一款試劑盒(EvercodeWholeTranscriptomeKit)，可以對100,000個細胞進行scRNA-seq。上周，在ASHG上，該公司推出了可進行一百萬個細胞的EvercodeMega，以及用于小型實驗的EvercodeMini。
一切都與概率有關
SPLiT-seq如何解析出一百萬個細胞?Rosenberg是這樣解釋的：如果你從100萬個細胞開始，將它們分成96個孔，每個孔大約有10,000個細胞。一個孔中的每個細胞都有一個條形碼。那是10,000個帶有一個條形碼的細胞——不完全是一個唯一的標簽。然后，將細胞匯集在一起??并再次隨機分配到具有96個新孔的第二個板中。當每個細胞開始采取獨特的路徑通過這些孔時，每個孔中都會添加第二個條形碼。這個過程通過第三輪和第四輪再次完成。隨著協(xié)議的進展，任何兩個細胞獲得相同條形碼組合的概率變得越來越小。
然而，兩個細胞有可能一起穿過所有四輪，形成雙聯(lián)體。在其他基于液滴的技術中，兩個細胞也有可能最終出現(xiàn)在同一個液滴中。當嘗試使用液滴擴大規(guī)模時，隨著放入更多的細胞，雙聯(lián)體的可能性會增加。
鑒于組合條形碼的指數(shù)性質(zhì)，SPLiT-seq產(chǎn)生的雙聯(lián)體數(shù)量較少。可以使用涉及小鼠細胞和人類細胞混合的標準方法來測量雙聯(lián)體。使用該技術，在100萬個細胞中，ParseBio試劑盒觀察到的雙聯(lián)體率為3.2%。真正的雙峰率是其兩倍。
戰(zhàn)利品歸勝利者所有
與任何打入已經(jīng)成熟市場的技術一樣，SPLiT-seq需要克服市場障礙有一條艱難的道路。在過去五年中，scRNA-seq呈爆炸式增長，這主要歸功于10XGenomicsChromium，它在全國各地的核心基因組學設施中啟動并運行。西海岸一家學術機構的一位研究人員告訴GEN，他們的實驗室已經(jīng)開始使用Chromium生成一個大地圖集，現(xiàn)在不打算改變。
任何一家DNA測序公司都可以證明，開發(fā)新基因組技術的游戲并不是那些厭倦競爭的人所玩的游戲。但當Rosenberg告訴GENParse的產(chǎn)品“幾乎在每個軸上都比競爭對手更好”時，他明確表示他已準備好離開替補席。
標簽：
免責聲明：本文由用戶上傳，如有侵權請聯(lián)系刪除！